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明场光学显微镜 vs 透射电子显微镜明场光学显微镜 vs 透射电子显微镜 明场光学显微镜,也就是我们在学校里经常见到的普通生物显微镜,是观察生物染色切片和水体浮游生物等标本的重要工具。明场光学显微镜高速发展的时期是19到20世纪。在20世纪30年代后,为了提高显微观察的放大倍率和分辨能力,电子显微镜逐步发展起来。其中,透射电子显微镜秉承了明场光镜的制样和观察套路,使生物样品观察的放大倍率又提升了上千倍。明场光镜和透射电镜都采用了透射成像的方式,都能观察生物标本的内部结构。 不少研究组在开展电镜观察实验之前,会有学生来咨询。最有趣的一类情况,莫过于学生带着一张封有染色切片的光学玻片,甚至带着一只活的小鼠,期望用电镜观察一下“超微结构”。遇到这类咨询,要想一两句话把事情解释清楚实属不易。因此,为了让大家直观、快速了解明场光镜和透射电镜的区别,为后续生物制样技术的理解做好铺垫,本文简单地科普一下二者的区别。 1 光镜和电镜用来放大成像的射线不同 光镜观察物象,需要用光线透过薄层标本。也就是说,光子束是光镜成像依赖的射线。几百年来,都是通过玻璃透镜折光来改变光线路径。所以,用玻璃透镜组使穿透标本后的光线偏折,从而实现物象放大,是光镜的成像原理。 电镜,顾名思义,使用的射线为电子束。20世纪初,在阴极射线管的研发基础上,垂直式电子枪成了电镜的标准射线源。电子通过磁场时,会在磁场作用下发生偏转。电镜就利用了这个原理,使穿透标本的电子束在强磁场的作用下改变前进路线,从而实现物象放大(图1)。可见,电镜放大物象的套路和光镜是类似的,只不过将玻璃透镜换成了电磁透镜。 2 光镜和电镜标本的制备要求不同 光镜采用的光子束,可透过最大厚度300多微米的标本。当今的石蜡制片、冷冻制片、滑行切片甚至振动切片方法,都能轻松将切片厚度做到几十微米甚至更薄。这给不熟悉光镜制样历史的人一个错觉:光镜观察几乎没有限制。如果不了解电子的特点,这一错觉常常迁移到电镜上,认为电镜放大倍率高多了,无所不能,而忽略了电子的穿透力很弱这一现实。 电子不同于光子,在常规80千伏加速电压下,顶多能穿透200多纳米厚的生物标本。电子束的穿透力还不到光束的千分之一。常规光镜石蜡切片的厚度大约4微米,已经相当于电子束穿透极限的约20倍。光镜制片中最精细的石蜡制片技术,能稳定切出的最小厚度,一般为1微米。可见,光镜制片的方法是不能胜任电镜观察的。电镜标本不光要在取材和固定的环节,把细微结构保存到最佳(光镜的甲醛固定液满足不了这个要求),还要改换包埋方法,形成远高于石蜡的支撑硬度;然后用比钢刀坚硬得多的金刚石刀刃进行切片。这样,切片的厚度才能降到200纳米以下。 3 光镜和透射电镜的标本载体不同 用明场光镜观察的切片,基本上都用载玻片裱贴(图2)。玻璃虽然透明,但那是对光束而言的。电子束无论如何也透不过载玻片。构成玻片的密集的硅、氧原子,对电子束来说,简直就是不可突破的铜墙铁壁,全部会被挡回来。既要扛得住电子束轰击产生的高温,又要保证电子束透过,镂空的金属载网是最佳的选择。直径约3 mm的铜网是最常用的载体。用于透射电镜观察的超薄切片裱贴在铜网上,再用尖头镊子小心转移(图2),是电镜工作者每天都要做的操作。 4 光镜和电镜的机身结构迥异 我们已经知道,明场光镜和透射电镜采用了不同的射线源,对标本厚度和制样技术的要求不同,切片载体也差异巨大。所以,镜体的结构当然就很不一样了(图3)。 明场光镜的光源是卤素灯泡或LED灯,一般放置在镜座部分。光束向上穿过载物台上的通光孔,带着标本的物象被物镜收集、放大。透射电镜的射线源是高压电子枪,位于机身的顶端,向下发射电子,穿过伸入镜筒中的样品杆上的铜网,带着物象信息继续通过下面的磁透镜而被放大。 由于电子穿透力极弱,空气中任何气体分子都会将其弹开,所以电镜的镜筒内部必须保持接近真空的状态。电镜主机的旁边,总会有几个附属机器在不断运转。这些机器就是维持镜筒内真空状态的机械泵、油泵(或分子泵)和空气压缩机等。此外,以电磁原理工作的器械,必然大量发热,所以电镜镜体还连接着水循环设备,随时保持镜筒的恒温状态。所以,电镜室总是被噪音笼罩。光镜可不需要这些装置,安安静静坐下,就可以观察标本啦。 人眼可以感受可见光。所以,光镜放大后的物象,我们只需要凑到目镜前,观察里面的影像就可以了。必要时,可接一个相机到目镜或专门预留的照相镜头上拍照。电镜采用电子束成像,不能用眼睛看,那样不仅看不见,还会被灼伤。电镜成像是通过荧光屏实现的。带有物象信息的电子束投射到荧光屏上,使屏幕出现明暗影像;人眼通过观察荧光屏的显像,就能看到电镜的物象。把荧光屏转换成胶片或感光器件,就能实现电镜拍照。目前,不少实验室已经采用电脑屏幕来控制光镜采图和电镜 |
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