指南概述了可以高效进行线虫研究的显微镜技术。线虫是一种广泛使用的模式生物，与人类有大约70%的基因同源性，是研究发育、神经科学、遗传学和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成为一个出色的遗传学模型系统。它可以进行高分辨率成像。主要的实验方法包括拣虫、转基因、荧光筛选、成像和记录。

显微镜和线虫研究

显微镜是研究线虫的必备工具。在这些步骤中都会用到它们：

1

“拣虫”：用金属挑针从琼脂平板上挑出虫子，转移到新的平板上进行培养或实验。

2

通过向线虫体内显微注射核酸进行转基因（基因改造）。

3

荧光筛选，鉴定表达转染荧光蛋白的转基因线虫。

4

在实验过程中对线虫（从胚胎到成虫的所有阶段）进行成像和记录。

这些任务通过体视显微镜、复合显微镜或共聚焦显微镜来完成。

显微课堂 | 线虫研究指南-针对线虫的相关工作

指南概述了可以高效进行线虫研究的显微镜技术。线虫是一种广泛使用的模式生物，与人类有大约70%的基因同源性，是研究发育、神经科学、遗传学和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成为一个出色的遗传学模型系统。它可以进行高分辨率成像。主要的实验方法包括拣虫、转基因、荧光筛选、成像和记录。

显微镜和线虫研究

来自秀丽隐杆线虫的细胞表达荧光蛋白SPD5-GFP（指示中心体标记，绿色）和Histon 2B-Cherry（指示细胞核，红色）。间期细胞中的两对中心体用白色箭头标出。该图像是经过ICC（即时计算去噪）和SVCC（小体积计算去噪）处理后的Z-stack的最大投影。

要“挑选”具有适当表型或转基因的个体秀丽隐杆线虫，或将线虫从一个平板移到另一个平板，研究人员需要使用立体显微镜和一个末端带有金属尖端的小工具。

与拣虫有关的挑战有：

对比度不够好时，难以识别线虫的关键解剖细节。

长时间拣虫会造成用户疲劳。

用工具处理线虫时，显微镜物镜下没有足够的空间。

视野不够大时，找虫子很麻烦。

不过，徕卡显微镜具有以下优势，可以克服这些挑战：

配备各种对比方法的透射光底座可实现高光学对比度，从而观察到虫体细节。

采用人体工程学模块，用户安装舒适，减少劳累和疲劳。

物镜下方空间充足，工作距离可达122毫米。

视野更大，更容易发现线虫。

琼脂板上有很多秀丽隐杆线虫，就像在挑虫时可能会看到的那样。

显微注射转基因

秀丽隐杆线虫的转基因通常是通过核酸显微注射完成的。显微注射通常使用配有注射装置的倒置复合显微镜进行。

对线虫进行显微注射面临着一些挑战：

对比度不足，无法观察到线虫的精细解剖细节，而这正是进行适当靶向定位所必需的。

没有足够的空间使用微型注射器。

设置不稳定时振动太大。

为了克服这些挑战，用户可以利用徕卡显微镜提供的优势：

光学对比方法，如DIC（微分干涉对比）或IMC（集成调制对比），可清楚地看到注入线虫的位置。

抗震装置（防震装置）稳定可靠。

能够使用精确的操作器（Narishige或Eppendorf）进行微量注射。

荧光筛选

要找到转基因成功的秀丽隐杆线虫，需要使用立体显微镜进行荧光筛选。

线虫荧光筛选存在一定的挑战：

荧光信号暗淡，难以观察荧光转基因。

老线虫虫和琼脂发出强烈的自发荧光。

由于视野较小，难以发现线虫，导致筛查时间延长。

使用徕卡显微镜可以通过以下方式克服这些筛选难题：

采用三光束技术的独立激发通道提高了信噪比，适用于体视显微镜。

使用专门设计的反射镜防止自发荧光，反射镜可与Leica透射光底座一起使用。

徕卡透射光底座提供大视场和多种对比方法。

一张成年雌雄同体秀丽隐杆线虫的Thunder拍摄的图像，展示了其性腺。该线虫用以下荧光染料进行了染色：DAPI（蓝色）指示细胞核，SP56（绿色）指示精子，RME-2（红色）指示卵母细胞，PGL-1（洋红色）指示RNA和蛋白质颗粒。图片由德国哈勒马丁路德大学的C. Eckmann提供。

成像和文件

筛选和鉴定转基因秀丽隐杆线虫标本后，高分辨率成像和精确记录对实验数据分析至关重要。要实现这一目标，需要显微镜配备高质量的摄像头或探测器以及兼容的成像软件。

线虫成像和记录方面的主要挑战是：

由于光散射的原因，在对线虫更深处的结构成像时会出现焦外模糊的现象。

避免光和热对线虫造成伤害。

利用基因编码报告器观察活体线虫的暗淡荧光（包括延时成像）。

使用徕卡显微镜可以克服这些挑战。优势如下：

利用图像增强功能，将线虫深处的细节可视化。

使用高质量的光学元件、适当的照明光源和灵敏的相机/探测器，减少光照射，降低对线虫的伤害。

利用宽场显微镜和高灵敏度显微摄像机的良好单噪比，促进实时成像。

必要时，使用转盘、共聚焦或光片显微镜获取更高分辨率的三维图像。

研究秀丽隐杆线虫的神经系统：使用徕卡共聚焦显微镜拍摄的表达荧光蛋白CFP（青色）、GFP（绿色）、YFP（黄色）和DsRed（红色）的线虫图像。